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Nature Aging!!!单细胞+空转助力探寻人类卵巢衰老奥秘!

2024-04-12

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题目:Spatiotemporal transcriptomic changes of human ovarian aging and the regulatory role of FOXP1

中文题目:人卵巢衰老的时空转录组学变化及FOXP1的调控作用

期刊:Nature Aging

影响因子:16.6

发表时间:2024.4.9

亚洲第一品牌威尼斯澳门人提供:单细胞转录组、空间转录组的建库测序和分析服务

合作单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院


背景简介

1.卵巢具有生育和激素分泌功能,随着年龄增加,卵巢功能在大约20-30岁时达到顶峰,30岁后开始下降,然后在50岁左右衰竭。

2.大多数女性会在45至55岁之间绝经,此阶段卵巢内卵泡耗竭,血液中雌激素水平下降,可能会导致心血管疾病、骨质疏松、老年痴呆、肥胖症、肿瘤等疾病的发生,因此卵巢衰老被喻为女性机体衰老的起搏器。

3.高分辨率的单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术可以用来研究细胞异质性,绘制器官衰老图谱。目前已有一些研究鉴定了人类卵巢组织中包含的细胞类型,以及小鼠和灵长类动物卵巢衰老过程中的细胞变化,但是人类卵巢衰老过程中的细胞类型和转录调控变化目前仍然未知。

4.卵巢发育是一个动态的过程,因此了解卵巢空间结构对于卵巢的衰老动力学研究是非常有必要的。空间转录组学可以将转录本映射到组织切片上,实现基因表达的空间可视化,有助于进一步探索卵巢衰老过程中的空间转录变化。


实验设计

单细胞转录组:

来自于9名捐献者的卵巢样本,被分为3组,分别是年轻组(Y)、中年组(M)和老年组(O);

空间转录组:

来自于15名捐献者的卵巢样本,被分为3组,分别是年轻组(Y)、中年组(M)和老年组(O);


研究结果

1:人类卵巢组织的单细胞和空间转录图谱

作者对来源于9名患者的卵巢样本进行解离并进行10x上机,经过质控共获得92965个细胞。对这些细胞进行降维聚类分群并通过经典的细胞类型marker基因注释,最终得到8种细胞类型,分别是颗粒细胞(GCs)、卵母细胞、卵泡膜和基质细胞(T&S cells)、内皮细胞(ECs)、平滑肌细胞(SMCs)、单核细胞、NK细胞、T细胞(图1a-b)。每种细胞类型的marker基因的GO富集分析结果显示,GCs中主要富集的通路与调节激素水平相关,卵母细胞中的富集通路与卵母细胞分化有关,T&S cells主要富集到了“细胞外基质”和“胆固醇转移活性”通路,而SMCs显示出在“肌肉系统过程”和“细胞骨架组织”通路中富集。这也侧面验证了单细胞注释的准确性(图1c)。

作者对来源于15名患者的卵巢样本进行OCT包埋并做空间转录组测序。通过单细胞数据和空转数据的联合分析,对空转数据进行了注释,识别出了位于卵泡中心的卵母细胞(图1d (i))、卵泡周围的GCs(图1d(ii))、广泛分布的T&S细胞(图1d(iii))和沿血管分布的SMC/内皮细胞(图1d(iv)/(v))。而免疫细胞,包括单核细胞、NK细胞和T淋巴细胞,主要分布于卵巢髓质(图1d(vi)、(vii)、(viii))。

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图1:人类卵巢组织的单细胞和空间转录图谱


2:卵巢衰老转录程序中的细胞特异性变化

作者对8种细胞类型中 O/Y、M/Y 和 O/M 组之间进行了差异富集分析,发现上调的差异基因富集到的KEGG通路主要与细胞衰老和细胞衰老相关通路有关,比如FoxO 信号通路, IL-17 信号通路, nuclear factor (NF)-κB 信号通路, NOD-like receptor信号通路等,下调的差异基因富集到的KEGG通路主要与细胞迁移、细胞外基质(ECM)-受体相互作用、雌激素信号通路、细胞外囊泡、氧化磷酸化、血小板活化、肌动蛋白细胞骨架调控和紧密连接有关(图2a)。因此作者又对不同组的细胞分别进行了细胞衰老评分,发现在衰老过程中,大多数卵巢细胞的衰老信号通路评分增加(图2b)。空间基因表达数据的通路评分结果也同样发现,老年卵巢的卵泡、皮质和髓质中细胞衰老和衰老相关分泌表型(SASP)信号通路的富集程度提高(图2c)。不同年龄的人卵巢脂褐素染色(脂褐素,细胞衰老的标志物)结果也显示脂褐素在卵巢衰老过程中的积累增加(图2d)。除此之外,不管是单细胞数据还是空转数据,衰老标志基因CDKN1A/p21也在老年组的所有卵巢细胞类型中均表达增加(图2e-f)。多重免疫组化 (IHC)结果显示,在GCs和T&S细胞中,CDKN1A阳性细胞逐渐增加(图2g)。对SASPs相关细胞因子进行分析发现在老年卵巢中其整体表达增加(图2h)。接下来,作者还进一步做了RT-PCR和Western blot去验证(见补充数据)。总之,这些发现表明,老年人类卵巢中的特定细胞类型可能表现出与细胞衰老相关的独特特征。

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图2:卵巢衰老转录程序中的细胞特异性变化


3:卵母细胞在卵巢衰老过程中的时空变化

作者通过拟时序分析帮助确定了卵母细胞3个不同的亚群(cluster a、b、c),其中年轻组的卵母细胞在三种亚群都有分布,而中年组的卵母细胞主要在a组,老年组的卵母细胞主要在c组(图3a-b)。轨迹分析显示,年轻组的卵母细胞处于发育轨迹的起点,而年老组的卵母细胞处于终点状态,提示在卵母细胞衰老过程中存在基因开关(图3c)。分析不同cluster在伪时间轨迹上的基因表达动态变化,发现三个阶段分别有749、418和575个DEGs。对这些DEGs进行GO富集分析,发现cluster a主要富集在“靶向膜的共翻译蛋白”、“核转录的mRNA分解代谢过程”和“翻译起始”,cluster b在“含胶原的细胞外基质”、“细胞外基质组织”和“细胞粘附的正调节”中表现出富集,cluster c中则是“细胞凋亡”、“双链断裂修复”和“细胞器裂变”,表明卵母细胞中的DNA损伤和凋亡(图3d)。因此作者进一步做了DNA损伤和修复基因的基因集合打分,发现在老年卵母细胞中,DNA损伤评分增加,DNA修复评分降低(图3e)。

单细胞数据的细胞通讯分析结果显示,卵母细胞与其他细胞类型之间的相互作用在老年组中显着增强(图3f),老年卵母细胞表现出配受体对MDK-LRP的表达升高(图3g)。随后作者又进行了空间基因集合评分,发现配受体对MDK-LRP1在卵母细胞和周围细胞中泛表达,并且在衰老组评分更高(图3h)。IHC染色结果也验证了这一点(图3i)。

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图3:卵母细胞在卵巢衰老过程中的时空变化


4:颗粒细胞在卵巢衰老过程中的时空变化

GCs包裹着卵母细胞并与其相互作用,但GCs在衰老过程中分类和变化目前还不清楚。因此作者进一步将GCs细分为3种亚型(GC亚型1、2和3)(图4a)。细胞占比统计结果显示,年轻组GCs以亚型1和2为主,而老年组GCs以亚型3为主(图4b)。各亚群top 8 marker基因气泡图显示,GCs亚型1表达已知标记基因如AMH、FST、HSD1S7B1、SERPINE2和PRKAR2B,以及之前未报道的基因如DSP和MAGED2(图4c)。接下来作者还对各亚群的marker基因进行了GO富集分析,具体结果见补充数据。总之,这些发现为深入了解人类卵巢中三个GCs亚群的转录特征提供了新见解。

接下来作者进一步检测了空转数据中颗粒细胞的分布。值得注意的是,三个不同的GCs亚群在空间分布上具有明显差异。GCs亚型1位于窦卵泡卵丘,2亚型位于卵泡壁层,3亚型在卵泡中广泛分布(图4d)。多重免疫组化 (IHC)结果也验证了该发现(图4e)。

随后作者又进一步用monocle2分析了不同颗粒亚群的细胞动态转换关系,发现GCs亚型1位于轨迹路径的起点(图4f-g)。早期GCs亚型1主要分布于年轻和中年卵巢,而老年样本中的GCs主要是分布于末端的GCs亚型3(图4h)。为了研究衰老过程中颗粒细胞衰老通路是否会发生变化,我们计算了细胞衰老评分,发现老年卵巢中所有三种类型的GCs均有增加(图4i)。相应地,CDKN1A在所有三种GCs亚型中也均表达上调(见补充数据)。免疫染色分析证实,老年卵巢GCs中CDKN1A蛋白水平升高(图4j)。空间转录组的基因集合打分也显示了老年组的GC表现细胞衰老和SASPs相关通路表达更高,特别是GC亚型1(图4k-l)。为了进一步验证,又对接受了辅助生殖治疗的21-47岁的志愿者取了GCs,以进一步探索细胞衰老(图4m)。结果发现,随着年龄22-47岁的增加,SASP相关基因的表达逐渐增加(LMNA,P = 0.0019;CDKN1A,P = 0.0269;IL-8,P = 0.0172)(图4m)。这些发现表明,细胞衰老通路是GCs衰老的一个潜在特征,这可能导致衰老过程中的卵巢功能下降。

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图4:颗粒细胞在卵巢衰老过程中的时空变化


5:T&S细胞在卵巢衰老过程中的时空变化

卵巢中T&S细胞占比很多,但T&S 细胞在衰老过程中分类和变化目前还不清楚。因此作者进一步对T&S 细胞进行细分,根据转录特征的不同定义了5种亚型(T&S1-5)(图5a),并展示了不同亚群的top marker基因和marker基因的GO富集结果。以STAR和CYB5A表达为特征的T&S1,表现出丰富的RNA和蛋白质合成过程(图5b-c),并在卵巢髓质中广泛分布(图5d)。T&S2,表达ECM相关基因,如COL1A1和COL3A1,与“细胞外囊泡”和“细胞外基质”通路相关,并位于卵泡周围(图5b-d)。T&S3表达肌成纤维细胞标记物ACTA2和TAGLN,在位于血管周围的超分子纤维通路和细胞骨架蛋白结合通路中富集(图5b-d)。T&S4,由FBLN1和CXCL2定义,位于外皮层,与“化学反应”和“对刺激反应的调节”通路相关,可能参与卵巢对外部应激的防御(图5b-d)。亚型5,表现为表达CD74、HLA-DRB1、CCL4和HLA-DRA的炎症样成纤维细胞,在 “抗原加工和呈递”和“细胞对干扰素-γ的反应”等通路中富集,可能参与排卵后修复。空间转录组数据也进一步展示了间质细胞不同亚群在空间分布上的异同,并且作者还利用T&S亚型细胞的标记物进行了进一步的实验验证(图5d-e)。

接下来作者通过轨迹分析研究T&S细胞亚型的动态转换关系,发现T&S细胞的亚型2占据了轨迹路径的初始阶段(图5f)。此外,我们还分析了不同组之间T&S细胞亚型的轨迹差异。值得注意的是,早期的T&S细胞主要存在于年轻和中年样本中,而老年样本中的T&S细胞主要存在于过渡路径的末端,提示在衰老过程中T&S细胞的类型可能发生变化(图5g)。

基因集合打分结果显示在衰老过程中,所有T&S细胞亚群的细胞衰老评分均有所增加(图5h),同时衰老组中的CDKN1A的表达上调(图5i)。空转数据和IHC结果证实CDKN1A升高,特别是位于皮质的4亚型(图5j,左、右)。空转数据的进一步分析显示,HMGA1、PIM1、CAV1等SASP相关细胞因子表达显著升高(图5k)。接下来作者又对21-47岁女性卵巢来源的T&S细胞进行了检测,结果发现,随着年龄22-47岁的增加,与衰老相关的HMGA1、PIM1、CAV1和NF-κB的表达也逐渐升高,这与scRNA-seq和ST分析一致(图5l)。这些发现共同表明卵巢衰老过程中T&S细胞存在衰老样特征。

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图5:T&S细胞在卵巢衰老过程中的时空变化


6:FOXP1是卵巢细胞衰老的核心调控因子

上述分析已经证实细胞衰老是卵巢衰老的潜在因素,特别是在GC和T&S细胞中。作者采用单细胞调控网络推理和聚类分析来鉴定GC和T&S细胞中的核心转录因子(TFs)。结果显示,FOXP1、SOX4和FOS在两种细胞类型中表达均降低,可能在卵巢衰老中起关键作用(图6a-b)。因此,作者使用人GC系(COV434)进行了FOXP1、SOX4和FOS的敲低,以研究它们对卵巢衰老的影响(见补充数据)。

人卵巢中FOXP1的表达显示出与年龄相关的hGCs和pT&S的下降(图6c)。在老年卵巢中的免疫印迹和IHC检测结果证实了这种下降(图6d-e)。接下来作者在COV434和pT&S细胞中沉默FOXP1,发现衰老相关(SA)-β-gal染色增加(图6f)。此外,FOXP1基因敲低后,与细胞衰老和DNA损伤相关的蛋白表达上调(图6g)。这些发现表明,与年龄相关的FOXP1的减少和衰老之间可能存在关联。

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图6:FOXP1是卵巢细胞衰老的核心调控因子


后续验证结果:在GCs中敲除FOXP1可加速卵巢衰老,喂食槲皮素可以保护中年小鼠的卵巢储备

作者后续构建了敲除小鼠模型,通过一系列生理生化指标测定发现,在GCs中敲除FOXP1可加速卵巢衰老。用槲皮素治疗生殖衰老小鼠发现槲皮素可以保护中年小鼠的卵巢储备(具体实验设计和分析结果详见图7-8。

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图7:在GC中条件敲除FOXP1可加速小鼠卵巢衰老

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图8:槲皮素治疗可保护中年小鼠的卵巢储备功能


总 结

本研究绘制了人类卵巢衰老的时空单细胞转录组图谱,并确定调节卵巢细胞衰老的关键分子FOXP1会呈现增龄性下降。槲皮素诱导的FOXP1的激活,有望成为延缓卵巢衰老的有效治疗策略(图8n)。总之,本研究加深了对人类卵巢衰老过程的理解,为研究潜在的治疗干预提供了宝贵的资源。后续可以继续探索FOXP1作为卵巢衰老诊断和治疗潜在靶点的有效性。


原文链接:https://doi.org/10.1038/s43587-024-00607-1