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IF11.4!RNA-seq带您探索希瓦氏菌的奥秘!!

2024-06-03

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广东省生态环境技术研究所在国际著名杂志《Environmental Science & Technology》发表了电子穿梭体介导的微生物胞外电子传递机制进行研究,揭示了脂溶性电子穿梭体可直接渗入细胞膜与周质蛋白反应完成胞外电子传递的新机制。本研究的RNA-seq测序以及部分分析工作由上海亚洲第一品牌威尼斯澳门人生物科技股份有限公司完成。


一、技术路线

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二、研究背景

电子穿梭体可显著加速胞外电子传递,但此前人们对于电子穿梭途径的认识并不全面,这项研究中,作者发现了一种新的电子穿梭途径,即亲脂性电子介体-刃天青(resazurin)介导的EET过程。


三、研究材料与方法

1.实验材料

对照组:不加刃天青的希瓦氏菌

处理组:加入刃天青的希瓦氏菌

2.测序平台

 Illumina novaseq6000

3.分析方法

 RNA-Seq、BES、SEM、In-situ FTIRs等


四、研究结果

1.验证刃天青可在细菌中穿过磷脂双层膜

在刃天青的作用下,编码外膜细胞色素的基因被下调。虽然细胞色素缺失显著降低了生物电流的产生量,仅为野生型的1-12%,但是在刃天青的处理下突变体菌株(ΔmtrA/omCA/mtrC)的生物电流产生量恢复到168 μA·cm-2,几乎相当于WT(194 μA·cm-2)的水平,这表明刃天青介导的电子转移不依赖于Mtr途径。

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图1. 脂溶性电子穿梭体可直接渗入细胞膜


2.WT  MR-1菌株转录组测序分析

为了进一步阐明电子转移基因是如何与刃天青相互作用的,进行了转录组测序分析,转录结果表明,在含有刃天青的处理中,共筛选了362个差异基因,其中mtrCAB和omCA等外膜细胞色素C的表达量全部显著下调,意味着微生物对外膜Mtr蛋白的依赖降低;而如果将外膜细胞色素C敲除,突变株ΔmtrA/omCA/mtrC在刃天青的介导下仍然能产生与野生型强度相似的电流,进一步证明了刃天青可替代外膜细胞色素C的作用。

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图2 转录组分析火山图

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图3 GO富集分析气泡图

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图4 刃天青介导的生物膜形成相关的差异表达基因


3.验证无膜外细胞色素的高效EET

Mtr通路被认为是S.oneidensis  MR-1中EET的重要组成部分,然而在细胞色素缺失突变体的MR-1中,最大电流约是WT细胞的一半,此外刃天青可以完全恢复MR-1的EET能力,即使在关键的电子转移基因缺失后也是如此。实验结果表明,无论关键的外膜电子转移基因(MTRA、OMCA和mtrC)是否被敲除,刃天青都能显著促进MR-1的细胞生长.

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图5 有无50μM刃天青的生物电化学检测


4.验证刃天青与胞外/膜内细胞色素的相互作用

刃天青恢复了外膜细胞色素缺失突变体的电子传递能力,但CymA基因的缺失几乎完全抑制了细胞的生长,为了进一步了解刃天青是否通过与CymA直接接触而介导电子传递,进而研究了突变体ΔmtrA/omcA/mtrC/fccA/cctA的电流产生和生物膜生长。结果表明,在没有FccA和 CctA的情况下,CymA可以直接将电子转移到刃天青,但直接电子转移速率很低,并且支持非常缓慢的细胞生长。根据基因敲除结果,刃天青的存在导致厌氧呼吸基因的下调,但电子传递保持不变,而cym, fccA和cctA这三个基因在刃天青介导的EET中起着关键作用。

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图6 突变株电流密度、扫描电镜图像和生物膜总蛋白质含量

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图7 S. oneidensis生物膜的电化学特性


五、小 结

本研究证实了低分子量、亲脂性强的电子受体,具有与周质蛋白和细胞内膜蛋白直接反应介导胞外电子传递的能力。由于自然界中大多数微生物不具有外膜细胞色素C,渗入型电子穿梭的方式可能具有广泛性,本实验为了解自然界电子穿梭体的作用方式以及穿梭体的工程化应用提供理论基础。


原文链接:https://pubs.aCs.org/doi/abs/10.1021/aCs.est.2C07862